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近年来，DNA折纸纳米技术已经成为一种在分子和机械水平上研究生物过程的通用工具。蛋白质修饰的DNA折纸结构作为可溶性试剂与细胞接触，附着在固体基质上或锚定在脂质双层膜(SLB)中，用于各种生物物理和细胞生物学过程的机制研究。但功能化DNA折纸时，在结合位点的特异性、产率以及保持蛋白质原有的功能等问题上仍然具有挑战性。
常用的功能化DNA折纸的方法有两种：一种是通过将蛋白质与寡核苷酸标签共价结合，然后标签与DNA折纸结构上延伸的订书钉链（Staple strand）互补杂交（方法1）。但带高负电荷的DNA磷酸骨架会影响产率及酶的活性。另一种方法是利用链霉亲和素(SAv)与生物素之间的特异性相互作用，将生物素化的蛋白质连接到DNA折纸结构上（方法2），可以保护蛋白质不受带负电荷的DNA的影响，但DNA折纸上的单个位点可能会被多达三种蛋白质功能化，无法从化学计量学上衡量产物。到目前为止，暂未报道关于系统性研究功能化DNA折纸结构的方法。
来自于奥地利维也纳技术大学的Eva Sevcsik研究员的团队结合单分子荧光显微镜和细胞生物功能分析，系统地评估和优化了上述两种常用的蛋白质与DNA折纸结构位点特异性结合的方法，该工作以“Strategies for the Site-Specific Decoration of DNA Origami Nanostructures with Functionally Intact Proteins”为题，发表在《ACS Nano》上。
如图1所示，借助胆固醇功能化的DNA的自发嵌入性，将DNA折纸平台锚定在SLB上。使用T细胞受体β链单克隆抗体H57-597片段H57-ScFv（又称配体）作为修饰蛋白，并在其C端上修饰生物素连接酶识别序列或未配对的半胱氨酸，用于与DNA折纸结构上的位点特异性结合，评估蛋白质是否成功功能化（图1B）。 基于上述两种功能化方式，作者采用DNA/PNA寡核苷酸标签，单价、二价和四价的链霉亲和素（mSAv、dsAv、tSAv），生物素化的短链（no linker，NL）或寡核苷酸，构建了七种与DNA折纸结合的模型。其中，H57-DNA、H57-PNA 采用方法1，H57-dsAv、H57-dsAv-NL、H57-mSAv、H57-tSAv及H57-tSAv-NL采用方法2。
图1 利用单链抗体片段功能化DNA折纸的示意图
接下来，该团队使用单分子双色共聚焦全内反射荧光(TIRF)显微镜评估了DNA折纸的功能化过程。荧光团YOYO（蓝色）用于标记DNA折纸结构，DNA-AS635P （红色）标记延伸的订书钉链，绿色圆圈表示在两个颜色通道中均检测到了信号，红色圆圈表示仅在一个通道中检测到信号(图2A)。作者测定了不同功能化方式下每个单独修饰步骤后的产率(图2B)，在不考虑DNA-AS635P的亚化学计量标记、荧光团漂白以及处于暗态下的荧光团的情况下，双通道的共定位分析表明了DNA折纸上的订书钉链杂交效率为84%。进一步考察总产率发现，几种不同功能化方式的总产率都在67%~74%之间，且采用H57-PNA 功能化的产率最高(图2C)。
图2 不同修饰方式的DNA折纸功能化效率
另外，作者从化学计量比上（严格意义上为1：1）评估了DNA折纸结构与配体结合。他们将单个功能化后DNA折纸和单个Alexa Fluor 555（AF555）标记的H57-scFv的信号亮度进行对比，以确定每个DNA折纸结构上的配体数量。由TIRF图像上H57-scFv的数量表明，H57-dSAv（图3A左）、H57-dsAv-NL、H57-DNA、H57-PNA 、H57-mSAv配体与DNA折纸结合的化学计量比为1：1，而采用tSAv修饰的H57-tSAv（图3A右）及H57-tSAv-NL出现了1：1、2：1、3：1的现象，难以从化学计量学上衡量DNA折纸与配体的结合。
图3功能化DNA折纸化学计量学研究
最后，作者探究了连接物（linker）的存在是否会影响DNA折纸结构激活T细胞的能力。将T细胞与SLB表面的DNA折纸结构、标记的粘附分子(ICAM-1)和共刺激分子（B7−1）相互作用（图4A）， H57-scFv密度由荧光信号分析得到，通过测定每个SLB的激活细胞百分比，绘制出激活百分率随H57-scFv密度变化的剂量-反应曲线(图4B)。除此之外，他们利用公式拟合，得到了T细胞的激活阈值，即半最大响应时的H57-scFv密度(图4C)。实验表明，与无连接物的模型相比，DNA折纸结构中的dsDNA连接物并不显著影响TCR配体激活T细胞的能力。而使用DNA寡核苷酸共价结合的配体，其激活阈值增大，破坏了配体的原有功能。
图4 功能化后的配体活化T细胞实验
总之，该团队系统地评估和优化了常用的两种蛋白质修饰DNA折纸的方法，并得出采用电中性的PNA取代DNA寡核苷酸来功能化DNA折纸的整体性能最佳的结论，该研究从位点特异性、合成效率及产率上为DNA折纸结构的功能化提供了指导方针，服务于广泛的生物学应用。
【文章链接】
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c05411
【DOI号】
https://doi.org/10.1021/acsnano.1c05411
【本文作者】
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