JACS | N端甘氨酸多肽的选择性荧光标记

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分享一篇近期发表在JACS上的研究进展,题为:A Method for Rigorously Selective Capture and Simultaneous Fluorescent Labeling of N‑Terminal Glycine Peptides。该工作的通讯作者是来自德克萨斯大学奥斯汀分校Eric V. Anslyn

    对多肽或蛋白的氨基酸侧链或N端与C端的选择性标记是位点特异性生物偶联的核心内容,但现有偶联方法难以区分N端不同氨基酸残基的伯氨基。本文中,作者将研究聚焦在多肽N端甘氨酸(Gly)残基的选择性标记。在生物体内,NGly是一种蛋白酶体的降解靶点,用于清除细胞凋亡过程中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)切割产生的多肽片段。此外,甘氨酸的修饰在合成高分子中也较为常见。因此,发展选择性NGly标记方法对多肽/蛋白和甘氨酸修饰材料的功能化至关重要。
    Gly和其他氨基酸的区别是没有取代基,因此作者设想能否寻找合适的反应将Gly的亚甲基“双活化”,形成2根新的化学键,而其他氨基酸则因侧基的存在无法反应,最终实现对NGly的高选择性。那么,什么样的反应能双活化”Gly的亚甲基呢?受胺与1,3-二酮的吡咯合成反应的启发,作者提出Gly可以和1,3-二酮发生如图1所示的多步反应,最终形成一个稳定的吡咯产物。
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1. 作者的反应构想

    2,5-二苯基吡咯是一种已知的荧光基团,因此作者首先研究了二苯甲酰基甲烷(DBM-1)和甘氨酸甲酰胺(GMA)的模型小分子反应(图2)。筛选后的最佳反应条件为DMF溶剂130 ℃微波反应器反应5 h。最终作者成功以21%的产率分离得到了目标产物PY,并确证了它的结构。
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2. 模型小分子反应

    在上述小分子模型反应的基础上,作者随后开展了多肽的标记实验。他们合成了六肽H2N-GAAYAA作为模型底物与DBM-1反应,其中Y(酪氨酸)的作用是为多肽提供UV信号便于HPLC分析(图3)。LC-MS和光谱表征支持成功得到了预期的Py-(G)AAYAA产物,修饰率为63%
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3. 模型小肽的反应。(a)反应式;(b)底物H2N-GAAYAA的吸收光谱;(c)产物Py-(G)AAYAA的吸收光谱;(d275 nm紫外光作用下的发射光谱;(e)底物和产物在254 nm下的照片。

    接下来,作者检验了上述标记方法对多肽链上其他氨基酸残基的兼容性,包括Lys(K)Ser(S)Gln(Q)Glu(E)Asp(D)Met(M)Cys(C)等(图4)。他们发现,除Cys外,其他氨基酸都是兼容的,而Cys用碘乙酰胺保护后也可兼容。其他氨基酸的α位伯胺和Lys侧基的伯胺在修饰过程中会转变为亚胺,但在酸性条件下可以将亚胺水解回到伯胺而不影响吡咯结构。即便Gly的相邻残基为大位阻的Tyr(Y)Trp(W)也不会显著降低修饰效率。
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4. 不同多肽的标记效率

    最后,作者验证了上述方法在多肽混合物中选择性标记NGly多肽的能力(图5)。他们在DBM-1结构的基础上引入了TMS保护的炔基,以便于标记多肽的后续点击反应。然后,将大过量的DBM-2加入N端分别为GFVWLY的多肽的混合溶液中,按原条件反应。反应混合物在酸性水解后,仅NGly多肽被成功标记。为了将标记多肽从混合物中分离出来,作者选择加入叠氮修饰的树脂借助CuAAC反应将含炔的肽捕获。最终,将树脂上的肽切下,仅得到N端标记了吡咯的产物,证明了该方法对复杂混合物的分析能力。
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5. DBM-2对多肽混合物的选择性标记

    综上,作者基于N端甘氨酸与1,3-二酮的吡咯生成反应实现了对复杂多肽混合物中含N端甘氨酸的多肽的选择性标记。
    最后,我们将此方法与另外两种NGly选择性修饰方法做一个比较(图6)。Rai法(Nat. Commun. 201910, 2539)和Kanemoto法(Angew. Chem., Int. Ed. 202463, e202320012)的实现依赖于Gly较小的位阻带来的速率优势,因此延长反应时间可能会导致选择性的降低,而Anslyn法(本文)则是基于Gly的“双活化”策略,因此其他氨基酸无法转化为预期吡咯结构,具有高度的选择性。此外,三种方法的修饰效率和产物结构也各不相同,前两种转化率较高,在修饰后仍保留了胺的结构,便于后续其他修饰反;而Anslyn法虽转化率略低且反应条件剧烈,但一步到位将伯胺转化为了吡咯荧光基团,在多肽分析方面有着巨大的应用潜力。三种方法各有优劣,适用场景也各不相同,都是多肽选择性修饰的有益探索。
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6. 三种NGly选择性标记方法的比较

作者:WS  审校:QJC
DOI10.1021/jacs.4c04141
Link: https://doi.org/10.1021/jacs.4c04141

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