分享的文献发表在Accounts of Chemical Research上，标题为Harnessing Nature’s Molecular Recognition Capabilities to Map and Study RNA Modifications，通讯作者是美国华盛顿大学化学系Jennifer M. Heemstra教授。

RNA修饰的失调与多种病症相关，包括癌症、自身免疫性疾病以及神经和代谢疾病。RNA修饰与疾病表型之间的功能关系才刚刚开始被理解，而关于RNA修饰在驱动细胞过程中所起的作用，还有很多地方有待研究。解决这些问题需要有效的技术来检测和定位这些RNA修饰位点。在这篇文章中，作者首先介绍了利用抗体来研究RNA修饰的方法，同时总结了化学标记方法中的一些工作。自然界已经进化出大量选择性识别和作用于RNA修饰的酶，这些生物分子的亲和力为该领域提供了一个新方向，作者对此进行了总结与展望。

常用的方法依赖于抗体作为亲和试剂。然而，抗体不易获得，并且通常具有非特异性。修饰碱基和标准碱基之间大小和结构相似，而大部分RNA修饰的丰度相对较低，这些原因使得高靶亲和力和特异性对于核酸检测至关重要。但是，抗体通常在没有进一步靶点验证的情况下使用，这可能导致假阳性结果。例如，针对m¹A开发的抗体与m⁷G之间存在交叉反应。此外，已经尝试使用肌苷-BSA偶联物获得多克隆抗肌苷抗体，但这些抗体与其他核碱基显示出非靶向活性。迄今为止，尚未产生可靠且高度选择性的抗肌苷抗体。由于这些挑战，只有小部分已知RNA修饰存在具有高选择性的有效抗体。

为了规避抗体的这些限制，研究人员试图开发化学方法，利用修饰碱基的独特反应性来实现与标记试剂的选择性反应。例如，RNA用丙烯腈处理，丙烯腈会与肌苷发生反应，并可用于在称为肌苷化学擦除测序 (ICE-seq) 的方法中绘制A-to-I编辑位点。ICE-seq的灵敏度有限，而丙烯腈与假尿苷具有交叉反应性，因此降低了 ICE-seq 检测肌苷的特异性。为此，作者课题组探索了使用丙烯酰胺来靶向肌苷。使用丙烯酰胺荧光素试剂直接标记基序，与肌苷反应形成N1-荧光酰胺乙基肌苷 (FAE¹I)。标记后，含有FAE¹I的转录本可以使用抗荧光素抗体和磁珠进行亲和捕获（图 1）。

另外，作者课题组通过用炔基取代荧光素来进行化学标记，利用标记试剂 N-(4-乙炔基苯基)-丙烯酰胺(EPhAA)与肌苷反应形成加合物N1-乙炔基苯基氨基乙基肌苷 (EPhAE¹I)。EPhAE¹I 的炔基可以通过铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)与叠氮官能化荧光团或其他官能团缀合，从而对肌苷进行定量（图 2）。化学标记可以改进现有的分析流程，但对于大多数修饰而言，实现选择性反应仍然是一个挑战。正如作者对丙烯酰胺荧光蛋白和苯丙烯酰胺的实验所证明，丙烯酰胺能有效地标记肌苷，但其应用受到与假尿苷的交叉反应的限制。

为了克服抗体和化学标记技术的固有局限性，研究人员向大自然寻求灵感，自然界已经进化出大量选择性识别和作用于RNA修饰的酶，利用这些天然存在的酶，可识别和绘制RNA编辑位点。利用RNA识别蛋白来识别编辑位点的一个例子是通过RNA免疫沉淀（RIP）。在该技术中，识别蛋白与特定修饰结合；抗体捕获该复合物后，通过实时荧光定量PCR或测序来检测RNA修饰。RIP利用了RNA结合蛋白的自然识别能力，但该方法仍然依赖于抗体。与之不同，氮杂免疫沉淀 (Aza-IP) 技术利用 m⁵C甲基转移酶(m⁵C-RMT)对m⁵C进行定位。在该工作中，细胞与胞苷类似物5-氮杂胞苷（5-aza-C）孵育。当m⁵C-RMT对5-aza-C进行甲基化时，m⁵C-RMT-RNA中间体被捕获。随后使用表位标签或抗m⁵C-RMT抗体富集。EndoV是一种天然存在的修复酶，在Mg²⁺作为辅因子时可切割含肌苷的底物。通过将辅因子从Mg²⁺改变为Ca²⁺，可调节EndoV活性，使其能够在不切割的情况下靶向结合肌苷修饰。该改变可有效地将EndoV从RNA切割酶转化为RNA结合酶。大肠杆菌EndoV（eEndoV），对单链RNA中的肌苷具有高度特异性。基于此，作者开发了核酸内切酶V免疫沉淀富集测序（EndoVIPER-seq）：将细胞RNA片段化并进行乙二醛处理，以破坏RNA的二级结构；之后，将样品与eEndoV-MBP复合物一起孵育，以捕获含肌苷的转录物；最后使用抗MBP磁珠分离富集的转录物，去除乙二醛，并制备洗脱的RNA样品用于高通量测序（图3）。

图3 EndoVIPER-seq对肌苷进行定位

文章编号：74

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https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.accounts.2c00287

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