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英文原题：Spatiotemporal Proximity Labeling Tools to Track GlcNAc Sugar-Modified Functional Protein Hubs during Cellular Signaling
通讯作者：Charlie Fehl 美国韦恩州立大学
戴元昊 北京大学
大家好，今天为大家介绍一篇来自ACS Chemical Biology的文章，文章的题目是“Spatiotemporal Proximity Labeling Tools to Track GlcNAc Sugar-Modified Functional Protein Hubs during Cellular Signaling”，通讯作者是来自美国韦恩州立大学的Charlie Fehl。在本文中，作者报道了一种能够对不同亚细胞定位的O-GlcNAc 蛋白质组进行时空特异记的策略。 蛋白质的O-GlcNAc修饰在细胞功能和环境适应过程中极为重要。然而，使用化学策略追踪功能性 O-GlcNAc 修饰仍有两个方面的挑战：对亚细胞位置的空间控制和标记期间的时间控制。迄今为止，还没有邻近标记工具直接针对O-GlcNAc糖基化修饰的蛋白。由于缺乏直接的导向O-GlcNAc的细胞内标记工具，使得进行特定空间和活细胞环境中的O-GlcNAc标记反应很困难，导致了无法以时空精度研究细胞内O-GlcNAc的行为。 本文中，作者团队利用了最近开发的生化邻近标记技术TurboID偶联在O-GlcNAc结合结构域GafD上，使其能够在细胞内标记O-GlcNAc糖基化蛋白和任何相关的蛋白复合物。他们把这种技术称作“GlycoID”，并且通过这种技术，对细胞内部不同区域的O-GlcNAc相互作用糖蛋白组学进行研究，获得了一些关于细胞内不同区域的O-GlcNAc相关功能的信息。他们还进一步研究了在胰岛素信号传导和细胞对于营养感知中的功能糖蛋白组学的变化，发现了一些以往功能未知但起到重要作用的蛋白质。（图1） 图1 蛋白质O-GlcNAc糖基化的常见过程以及该工作”GlycoID“的构成以及作用原理示意图
首先，作者团队证明了Lectin-GafD和mTurbo可以在Hela细胞中被稳定融合和表达。由于O-GlcNAc糖基化修饰主要发生在细胞的细胞核和细胞质中，通过对V5-和3xHA表达标签进行免疫荧光染色，作者团队证明，添加了细胞核或细胞质定位结构的GafD-Lectin和mTurbo蛋白能够特异性地表达在Hela和HEK293T细胞的细胞核或细胞质中。他们将表达100 μM生物素的细胞与O-GlcNAc糖苷孵育6小时，然后进行细胞裂解和O-GlcNAc免疫印迹，O-GlcNAc 和生物素的荧光重叠表明GlycoID在HeLa 细胞中实现了O-GlcNAc 糖基化蛋白的生物素标记。为了验证 GlycoID的表达不会破坏 O-GlcNAc 功能并影响细胞内O-GlcNAc 水平，作者团队在GlycoID 标记的细胞中进行了全局 O-GlcNAc 免疫印迹实验，结果表明GlycoID的结合作用不会影响细胞中O-GlcNAc的标记水平。（图2）
图2 GlycoID的融合表达及其对细胞中不同区域的O-GlcNAc糖基化蛋白质的标记能力确认 随后，作者团队对这些GlycoID工具富集到的O-GlcNAc糖基化修饰的蛋白进行了基于LC-MS/MS串联质谱的蛋白质组学研究，以确定哪些蛋白被GlycoID所标记。细胞核靶向的GlycoID共获得了102个O-GlcNAc糖基化的蛋白，经过与数据库的比对，鉴定出的102个鉴定的蛋白中有49%是已知的O-GlcNAc蛋白。由于邻近标记工具的特性，GlycoID还能够标记与亚细胞空间中的靶蛋白有物理结合作用的蛋白质，因此GlycoID标记到的蛋白中有31个是与O-GlcNAc靶蛋白有蛋白-蛋白相互作用（PPI）的蛋白，13个是OGT糖基转移酶的相互作用伙伴蛋白。对这些标记到蛋白绘制相互作用图谱并进行基因本体分析，发现这些蛋白大多与mRNA结合、转录调控、基因表达和剪切相关。在细胞质的GlycoID标记中也能获得相似的结果。（图3） 图3 GlycoID在细胞核和细胞质中标记的O-GlcNAc蛋白质组学分析 最后，作者团队利用该GlycoID标记方法，对营养感知和胰岛素信号传导过程中的细胞功能性 O-GlcNAc 糖蛋白组学进行了研究，从而体现GlycoID标记的时间特异性优势。他们比较了夜间血清饥饿处理细胞组和胰岛素处理细胞组的蛋白表达情况差异，在对细胞核O-GlcNAc蛋白标记的过程中发现，22种蛋白在血清饥饿处理组和胰岛素刺激组的细胞之间被识别。对这些蛋白质的相应功能进行分析，发现只有少部分蛋白的功能被认为与O-GlcNAc糖基化的调节相关，如 ABCF1（控制翻译起始）和 CDK12（一种参与调节细胞周期的激酶）。这表明在胰岛素信号转导过程中的O-GlcNAc糖基化蛋白质组学还需要进一步的功能研究。（图4） 图4 通过GlycoID研究胰岛素信号转导过程中的功能性O-GlcNAc蛋白质组学 综上所述，该文章提出了一种基于邻近标记策略TurboID的优化方案，使其能够对细胞内的O-GlcNAc蛋白质组学进行时空特异性的研究。通过添加不同亚细胞定位的标记序列，该邻近标记策略能够靶向到不同的细胞组分。作者团队通过LC-MS/MS蛋白组学研究和数据库比对，发现了该GlycoID策略不仅能够准确识别O-GlcNAc糖基化的蛋白质组，还能够对空间上与这些O-GlcNAc糖基化标记蛋白有相互作用的蛋白质进行识别和功能鉴定。利用这种方案，作者团队研究了细胞中针对营养元素感知和胰岛素信号转导的相关O-GlcNAc糖蛋白组学，并有望将这种策略拓展到一些疾病模型中O-GlcNAc糖基化蛋白水平变化和功能的研究中。 ACS Chem. Biol. 2022, ASAP Publication Date: June 12, 2022 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.2c00282 Copyright © 2022 American Chemical Society
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