分享一篇发表在JACS Au上的文章Development of an α‑Klotho Recognizing High-Affinity Peptide Probe from In-Solution Enrichment，通讯作者是来自MIT的Bradley L. Pentelute教授和来自Calico Life Science公司的Magdalena Preciado López。Pentelute教授的研究方向包括蛋白质与多肽的化学合成、修饰和工程化等。α-Klotho是一种与衰老相关的跨膜蛋白，其能与FGFR相互作用，与糖尿病、癌症和阿尔茨海默症等年龄相关的功能障碍有关。尽管已有人类和小鼠Klotho抗体可用，但仍缺乏检测体液和组织中Klotho天然构象的工具。最近，FGFR-Klotho-FGF23三元配合物的结构得到解析，导致FGF23 C末端模拟肽Pep-10的开发，然而，Pep-10对Klotho仅具有微摩尔级亲和力，作者团队此前的工作优化了Pep-10，使其亲和力达到10-100nM，但分子量大于4kDa，限制了在生物系统中的应用。在本文中，作者希望降低肽结合剂分子量的同时提高亲和力。作者以Pep-10为基础，偶然发现在N端添加芴基使得亲和力提高了约100倍。随后，作者进行了丙氨酸扫描，发现D5、P6和R11对Klotho结合至关重要，且N端和C端若干残基的截短并未损失亲和力。随后，作者使用split-and-pool固相合成方法，将热点残基的突变体组合成一个聚焦肽库，然后使用最近建立的高效尺寸排阻色谱(HPSEC-LC-MS/MS)的富集平台AS-MS来筛选该肽库，该方法使用SEC将未结合蛋白的肽与结合肽分离开，随后使用质谱测序鉴定结合蛋白的肽序列，得到最优肽序列K17’。随后，作者进行第二轮AS-MS筛选，在K17’的N端偶联各种小分子基团，得到2-苯基-4-喹啉偶联肽K18，其KD=0.9±0.3nM，相比亲本肽Pep-10提高了6600倍。得到K18肽后，作者将其与生物素偶联，使用链霉亲和素磁珠pull-down验证了K18能够直接与HK-2细胞裂解液和肾脏组织裂解液中的Klotho结合。最后，作者还将K18与TAMRA偶联，使用荧光显微镜进行了成像实验，用于细胞中Klotho的荧光标记。总之，作者使用AS-MS这种溶液富集的方法发现了高亲和力的肽结合剂探针，能在复杂的细胞环境中与Klotho蛋白结合，有望成为肾病和衰老相关疾病患者的潜在诊断工具。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.3c00650文章引用：DOI：10.1021/jacsau.3c00650
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