生物素化标记指在一个分子上加上一个生物素标签。生物素是一个天然分子，也称为维他命B7。在日常生活中，它对我们的健康饮食非常重要，同样在实验室里也是非常有用的蛋白偶联分子。在实验室里，生物素化的目的是建立生物素-亲和素的亲和性链接。亲和素和生物素的亲和常数非常高（K=10¹⁵），一旦生物素和亲和素结合，就很难解离，这种亲和力可以抵抗温度、pH和盐浓度的变化，并且特异性非常高，通常被认为是一种类似于共价键的结合力。这些性质使得生物素化可以作为一种很有用的工具被用来发展新的纯化和检测方法。由于亲和素等电点比较高，并且存在糖链结构，在使用亲和素与生物素结合的过程中会存在高非特异性结合的问题。链霉亲和素保留了亲和素的结合特性，并且去糖基化结构可以显著的防止非特异性结合的问题。

图1：生物素分子结构示意图

生物素化试剂的溶解性很大程度上会影响蛋白或者其他大分子的标记能力。蛋白根据氨基酸的侧链和蛋白构型具有亲水和疏水区域，而这些区域会根据生物素化试剂的溶解性促进或者阻碍生物素化过程。在一些研究中需要生物素化的蛋白具有很高的亲水性。例如，对于细胞的表面分子表达或者示踪表面分子内化过程研究时，就需要生物化蛋白具有亲水性以限制生物素化标记的蛋白穿过疏水性的细胞膜，从而留在细胞的表面。具有PEG链的生物素具有较高的溶解性，可以提高蛋白的生物素化过程，并且阻止生物素化蛋白聚集。

图2：具有4个聚乙二醇链(PEG4)的生物素分子

在生物素化的过程中，通常会采用摩尔量过剩的生物素偶联，以确保所有的蛋白或者是需要生物素化的分子结合上生物素化分子。然而，这也就意味着在反应体系中会有过剩的未结合的生物素分子。这些过剩的未结合的生物素分子需要采用离心超滤的方式去除。或者，采用层析树脂可以滞留未结合的生物素，从而使得较大的蛋白-生物素结合物首先流出并被收集。如果生物素化结合物带有磁性，很容易通过磁分离进行收集。

当生物素化的样品从未结合的生物素分离纯化后，可以用4-羟基偶氮苯-2'-羧酸 (4’-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid，HABA)染料检测蛋白生物素化的程度。HABA染料可以结合亲和素分子，并且在500 nm处有一特征吸收峰。当HABA-亲和素与生物素化样品相结合，生物素由于与亲和素有更强的结合力会取代HABA分子，吸收便会降低。

蛋白或者抗体一旦生物素化，便可以结合在亲和素修饰的固相基底，如磁性材料或者是琼脂糖珠子上，进行免疫共沉淀，结合在树脂柱或者平板表面用作ELISA。

一些下游应用需要生物素化的蛋白可以在被链霉亲和素载体捕获后再重新分离，例如对于一些以采用链霉亲和素磁珠为载体对生物素化蛋白进行捕获，需要进一步去除磁珠对样品进一步分析。而亲和素-生物素复合物的结合能力很强，若采用强变性缓冲液来破坏它们的相互作用并释放生物素化蛋白会导致蛋白天然结构性能的破坏。通常有两种方式解决这一问题：首先可使用生物素的环状胍基类似物2-亚氨基生物素（2-iminobiotin）。2-亚氨基生物素表现出与链霉亲和素pH依赖性的相互作用。在高pH下（pH=9），2-亚氨基生物素能与链霉亲和素以高亲和力（K=10¹⁵）特异性结合，但在酸性pH值(pH=4)， 亲和力变弱（K=10⁸），可以温和地从链霉亲和素上解离下来。另一种方式是采用可以断裂的生物素化试剂。可以断裂的生物素化试剂在生物素分子的空间延长臂上有一个二硫键，在一些还原试剂如二硫苏糖醇、巯基乙醇或者是硼氢化钠的作用下，二硫键会被打开，生物素化探针和亲和素结合物会被释放出来。

图3：可以裂开的生物素化试剂。这些试剂通常被设计成具有二硫键，在还原条件下会裂开（虚线所示）并且从标记的蛋白上（绿色）释放出生物素（蓝色）。

生物素化蛋白或核酸与链霉亲和素载体结合是一个万能的工具。

来源：NYCY 纳米岛