分享一篇近期发表在Bioconjugate Chemistry上的文章，题目为“Multifunctional Proximity Labeling Strategy for Lipid Raft-Specific Sialic Acid Tracking and Engineering”。文章的通讯作者为南京大学的焦建伟研究员和山东第一医科大学的宋聪副研究员。脂筏(lipid raft)是一种在细胞膜中具有独特结构和功能的亚细胞结构。这些结构可以通过特定的脂质和蛋白质来调节与其他膜组分的相互作用，并参与细胞胞吐、胆固醇转运和信号转导。糖基化特别是唾液化，增加了蛋白质的异质性和功能多样性，是许多细胞相互作用的前沿。脂筏可以特异性聚集糖基化蛋白参与细胞代谢和信号转导过程中。脂筏上的唾液酸（Sia）常被认为是甲流病毒和新冠病毒等病毒侵入细胞时的结合位点。因此，迫切需要开发新的方法来示踪脂筏内Sia的动态变化。目前大多数方法只能对Sia进行全局的分析，并不能对特定区域的Sia进行检测。因此，作者开发了一种具有空间特异性的细胞外共价标记方法，并构建了一种多功能邻近标记（MLP)平台（图1）。作者合成了一种霍乱毒素B亚基（CTxB）与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的探针HRP-CTxB，CTxB是鉴定脂筏的金标准，它可以特异性地与脂质筏标记物GM1结合，从而将HRP定位到脂筏上，HRP催化DBCO-phenol（DP）与富电子氨基酸结合实现对脂筏特异性蛋白的标记。但Sia不是这种标记的底物，所以作者用NaIO4氧化Sia的C7位置，将其转化为醛基，通过采用醛基与hydrazide-phenol（HP）间的正交反应，成功地在Sia上安装了一个活性苯基羟基，有效地将Sia转化为HRP的标记底物，经由HRP催化Biotin-phenol（BP）实现对脂筏特异性Sia的标记。
图1. 脂筏特异性蛋白和Sia标记的多功能邻近标记策略以及MPL平台的推广与应用。
在HRP-CTxB成功合成后，作者通过共聚焦和流式细胞术测试了MPL策略用于脂筏特异性蛋白标记的可行性（图2）。随着HRP-CTxB浓度的升高，脂筏蛋白的标记强度先升高后降低，以OVCAR-3细胞为模型，证实MPL策略可以成功实现对脂筏特异性蛋白和Sia标记。同时验证了MPL策略在SKOV-3细胞上的可行性。
图2. 基于MLP的脂筏特异性蛋白和Sia标记策略的可行性。
接下来，作者从脂筏靶向特异性和Sia靶向特异性两方面探讨MPL方法的特异性。作者设计了两个实验，包括人工破坏细胞脂筏和去唾液酸化，同时监测脂筏特异性蛋白和Sia在变化过程中的动态表达。观察到甲基-β-环糊精(MβCD)去除脂筏中的胆固醇处理过的细胞上脂筏的荧光信号和经唾液酸酶去除Sia处理后的Sia上荧光明显减弱，表明MPL可以实现脂筏靶向特异性和Sia靶向特异性标记（图3）。
图3. 破坏细胞脂筏和去唾液酸化后脂筏特异性蛋白和Sia的动态表达。
随后作者发现MPL策略可以被用来有效地追踪踪脂筏特异性Sia的自我恢复(图4)。从细胞表面释放Sia后，脂质筏特异性Sia水平急剧下降。当在完全培养液中进一步培养时，脂质筏特异性Sia迅速恢复，并在24小时内几乎更新至97.1%，在24至36小时的持续孵育期间，细胞脂质筏特异性Sia过度恢复至127.1%，这可能是因为唾液转移酶水平的增加而导致。当细胞进一步孵化至48小时后，脂质筏特异性Sia水平在过度恢复后恢复正常。与筏特异性Sia的动态和持续更新相反，筏特异性蛋白的信号传导保持稳定，表明Sia的变化不影响HRP-CTxB的结合。此外，细胞整体Sia的自我更新与筏特异性Sia相似，两者都表现出一定程度过度自我更新。这些研究表明反馈机制参与调节脂筏特异性Sia以维持糖基化稳定性。
图4. MP策略和Sia编辑研究脂筏特异Sia的自我更新。
作者用MPL方法追踪胆固醇衰竭时脂筏特异性蛋白和Sia的消耗和修复的动态变化（图5）。经MβCD处理后，脂筏特异性蛋白和Sia信号分别减少了61.6%和67.1%。而且在加入HMG-CoA还原酶抑制剂孵育12 h后观察到脂筏特异性蛋白和Sia的荧光信号均减弱，表明HMG-CoA还原酶抑制剂抑制了脂筏的修复。而在恢复培养一段时间后，脂筏特异性蛋白和Sia信号恢复增强。结果表明OVCAR-3细胞的迁移随着脂筏的破坏而减弱，并随着脂筏的修复而增强，表明脂筏在细胞迁移中起重要作用。这一发现可能有助于从脂筏调节的角度调控细胞功能。
图5. 胆固醇衰竭时脂筏特异性蛋白和Sia的消耗和修复的动态变化。
最后作者利用MPL方法操纵脂筏特异性糖基化，通过生物正交反应将叠氮基团引入细胞（图6）。脂筏特异性Sia信号随着N3-Sia浓度逐渐增加而增强，而相应的Cy5信号的逐步下降。与内源性表达的Sia相比，该方法使脂筏中的Sia增加了189.0%。该方法简单、高效且与活细胞兼容，不需要事先对细胞进行遗传干预。新引入的聚糖附着在活细胞表面的富电子氨基酸上。这些发现表明聚糖可能对生物功能的调节起到重要作用，从而用于细胞工程。
图6. 通过MPL方法操纵脂筏特异性糖基化。
综上所述，作者开发了一种MPL 策略。HRP 和 CTxB 的偶联功能作为催化标记模块，含有富电子氨基酸的脂筏特异性蛋白是HRP介导的邻近标记的底物，从而能够标记脂筏特异性蛋白。从而实现示踪细胞脂筏特异性蛋白和Sia的动态变化，还可以进行脂筏的特异性唾液酸化修饰。
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