电化学因其对基本反应参数的精确控制、温和的反应条件和与生俱来的可扩展性等众多特点，近年来已成为小分子合成的一种强有力的方法。尽管这些优势使其成为对蛋白质等复杂生物大分子进行化学选择性修饰的有效策略，但目前靶向天然氨基残基损害蛋白质标记位点和化学计量以及脱靶效应导致了此类应用的开发程度仍然很低（图1a）。因此，在本文中，作者提出了“具有化学选择性的羟基吲哚的电化学标记”策略（eCLIC; 图1b）：通过遗传密码扩展技术（GCE）将5-羟色氨酸（5-hydroxytryptophan，5HTP）引入靶蛋白的特定位点，随后与芳香胺之间的电化学偶联反应产生稳定的共轭物，这种反应能在温和的条件下对全长蛋白质进行特定位点标记。

Fig 1.eCLIC电化学标记策略

基于5HTP与其他芳香族氨基酸的氧化电压分析，其相对较低的氧化电压显示了5HTP选择性氧化修饰优势潜力（图2a）。作者构建了在151位点表面暴露5HTP的绿色荧光蛋白（sfGFP-151-5HTP），在30min内可以实现和N,N-二甲基苯胺1a成蛋白电化学偶联（图2b）。接下来，作者试图降低所需的苯胺底物浓度（图2c）和扩展不同结构芳香胺官能团（图3a）来优化eCLIC反应条件。

Fig 2.eCLIC反应条件和优化

除了sfGFP之外，作者还构建了99位点5HTP的肌红蛋白（Myoglobin-99-5HTP）和69位点的HER2纳米受体（anti-HER2 nanobody-69-5HTP），eCLIC都能有效地修饰靶蛋白(图3b，c)。这些结果表明了eCLIC用于位点特异性蛋白质生物结合的普适性和灵活性。

Fig 3.eCLIC底物范围和普适性

为了探索eCLIC修饰全长抗体的可行性，作者重组表达抗HER2抗体曲妥珠单抗，在重链的121位点特异性结合5HTP（Trastuzumab-HC-121-5HTP）（图4a）。之后使用eCLIC策略将与荧光素偶联苯胺底物13反应，SDS-PAGE（图4b）和MS分析（图4c）表明其重链与荧光团的有效选择性标记，而轻链和相应的野生型抗体没有被修饰。FACS分析表明该抗体-荧光团偶联物可以标记高表达受体的SK-BR-3细胞（图4d）。这些结果表明：eCLIC可用于有效地生成各种应用的全长抗体的功能性偶联物。

Fig 4.基于eCLIC制备全长抗体的功能偶联物

最后，为了验证eCLIC标记策略可以和其他生物正交反应互相兼容，作者分别表达了在151位点引入三种不同的ncAAs（5HTP，AzK和CpK）的sfGFP蛋白，并且针对不同的sfGF突变体进行三种不同的标记反应（SPAAC，IEDDA，eCLIC）都能实现三种反应标记的互相正交性（图5a）。随后，作者分别在位点3和151构建了含有5HTP和AzK的sfGFP蛋白（图5b），ESI-MS分析表明可以通过eCLIC和SPAAC反应实现对蛋白特定位点的双标记（图5c）。这些结果证实了eCLIC与其他生物正交反应的兼容性，并且可以一起用于促进精确的多位点蛋白质标记。

Fig 5. eCLIC反应与SPAAC和IEDDA反应兼容

综上，本文提出了一种新型的基于电化学对蛋白质化学选择性修饰（eCLIC）策略，该方法与已建立的生物正交反应（SPAAC和IEDDA）相兼容，从而能够在具有不同标签的两个不同位点对蛋白质进行位点特异性修饰。

文章作者：WCJ

原文引用：10.1038/s41557-023-01375-y