为大家分享一篇最近发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题目为 Facile Preparation of Carbohydrate-Containing Adjuvants Based on Self- Assembling Glycopeptide Conjugates。这篇文章的通讯作者是来自北京大学药学院的董甦伟教授。 糖是一类生物体中普遍存在的分子，具有多种生物活性，包括免疫刺激能力，这使得它们有潜力成为一类新型疫苗佐剂。然而，它们的结构复杂性和异质性给理解其作用机制和进入临床应用带来了极大的挑战。 在本文中，作者研究了一个苯丙氨酸衍生的糖肽体系，该体系可以用多种低聚糖修饰，优化的肽结构可以有效地携带各种寡糖，并自组装成稳定的纳米结构，在体外结合实验中显示出与C型凝集素受体(C-type lectin receptors, CLRs) 蛋白的不同亲和力；此外几种甘露糖基化肽在体内表现出强大的免疫刺激作用（图1），有望应用于疫苗佐剂的开发。图1. 自组装糖肽偶联物的构效关系研究和在免疫刺激中的应用。 作者设想自组装糖肽可以作为一个平台通过多价呈现表位来放大寡糖结构的差异，并可由此来探究构效关系。基于之前的研究工作，作者设计了如图2a所示的肽序列，该序列包含一个三苯丙氨酸作为疏水区组装核心、C端亲水的磷酸化丝氨酸和糖基化的丝氨酸。作者采用固相多肽合成制备了含有单、双及三甘露糖修饰糖肽，分别记为A1m、A2m和A3m。A1m在水溶液中会组装成球形结构，而A2m和A3m在水中孵育72 h后则会聚集形成纳米纤维或纳米带（图2b）。图2. 糖肽偶联物GPCs的化学结构与组装行为 (Scale bar = 200 nm) 考虑到纳米结构的形态可以影响其性质，包括生物活性，作者希望设计一个组装行为更加保守的糖肽序列（即在与各种低聚糖功能化后产生一致的纳米结构），以评估更广泛的聚糖。因此作者尝试对糖肽序列和端基进行了改变（表1），观察不同序列中单糖修饰糖肽的聚集行为。将苯丙氨酸替换为正亮氨酸 (Nle) 后会使糖肽偶联物形成不稳定的纳米结构 (entry 2, 3)，而增加疏水基团的比例会使糖肽偶联物不可溶解(entry 4, 5)；但当C端由羧基改为酰胺时则会形成稳定的纳米带结构(entry 6, F1m)。这些结果表明，与疏水性Nle相比，三苯丙氨酸核心提供的额外π-π堆叠相互作用对于维持肽的自组装至关重要；此外，减少序列中的负电荷可以促进纳米带的形成。 因此接下去作者就以F1m为模板，制备了多种不同低聚糖取代以及不同糖苷键的糖肽偶联物 (glycopeptide conjugate, GPCs)。从高甘露糖型N-聚糖中选取具有代表性的截断结构作为寡糖表位（图3），包括α-1,2-甘露糖(F2m1)、α-1,3-甘露糖(F2m2)等等；除了O连接的寡糖外，作者还合成了N连接的寡糖，包括图3所示的F1g、F2g、F9x和F11x。作者在制备得到O-糖基化的丝氨酸 (Ser) 和N-糖基化的谷氨酰胺 (Asn) 后将其做成Fmoc氨基酸，再用固相多肽合成法制备GPCs。同时作者还制备了在N端荧光素FITC标记的糖肽用于细胞实验和动物实验的可视化。 作者用透射电镜(TEM)表征了这些GPCs的自组装特性，对于O-甘露糖化的GPCs，在3 mM浓度的水溶液中均会形成纳米纽带状结构，并且zeta电势均较高且负，表明稳定性较高；CD光谱分析表明，自组装体中存在β-折叠结构。有趣的是，N-糖基化修饰的GPCs会导致形成纳米纤维或松散的纳米球，表明糖基化位点的结构差异可能会影响形成的超分子结构。图3. 含有不同O-或N-聚糖的自组装糖肽偶联物的设计。 由于O-聚糖修饰的GPCs可以形成组装结构一致的纳米纽带，作者利用表面等离子体共振(SPR)光谱研究了它们对与五种具有生物学意义的蛋白质的结合能力，包括DC-SIGN、Dectin-2、FIMH、Langerin 和Mannose Receptor (MR)。SPR曲线分析显示，糖肽纳米带与这5种蛋白具有明显的浓度依赖性和饱和结合行为。相比之下，F0g衍生的非糖基化纳米带的结合可以忽略不计，有效地排除了非特异性相互作用的影响因素；而糖肽衍生的纳米结构的平衡解离常数(KD)范围为0.39 ~ 50 μM，其亲和力比未修饰的甘露糖高约3个数量级。该结果说明了由这些糖肽的超分子组装促进的多价相互作用是与蛋白结合的关键。图4. GPCs形成的纳米带与不同甘露糖结合蛋白的结合情况。 高甘露糖型N-聚糖通过与CLRs(包括DC-SIGN、MR和dectin-2)结合，在病原体内吞和免疫细胞活化中发挥重要作用。基于体外结合实验的结果，作者选择了对CLRs具有高结合亲和力的糖肽F2m1、F3m1、F3m2、F3m4和F3m5，研究其纳米带形式的免疫刺激作用。结果表明，这些GPCs可以促进巨噬细胞对卵清蛋白OVA的摄取（图5a-c）；同时，OVA的摄取会被一些聚糖抑制剂所抑制，而加入GPCs后则会恢复（图5d-f）。这些结果表明，GPCs的促内吞作用可能是通过免疫细胞上的CLRs介导的。在内吞作用之后，巨噬细胞在抗原的后续加工和呈递中发挥关键作用，这对于激活初始T细胞至关重要。流式细胞术分析显示，含F3m2和F3m5组CD86和MHC-II的表达水平明显高于对照组（图5g, h）。图5. GPC佐剂增强抗原在免疫细胞中的内吞、加工和呈递。 最后作者在小鼠体内评估了体外表现优异的GPCs作为疫苗佐剂的效果，并且结果与传统铝佐剂进行对比。结果表明F3m2和F3m5表现出最明显的免疫刺激作用，其抗OVA IgG滴度比单独含OVA组高约6倍，与铝佐剂效果相当。该结果证明了GPCs在疫苗开发中作为佐剂的巨大潜力。 总的来说，本文开发了一种基于糖肽偶联物的自组装系统，能够产生均匀的纳米带结构。基于该系统，本文研究了各种O-低聚糖肽偶联物的结构-活性关系，鉴定了不同糖肽偶联物与甘露糖受体蛋白的结合能力、在细胞实验中对抗原的内吞加工呈递能力以及在小鼠体内的免疫刺激活性。这些糖肽偶联物可以进一步优化，有望发现具有更强免疫刺激特性的安全有效的疫苗佐剂。DOI: 10.1002/anie.202309140Link: https://doi.org/10.1002/anie.202309140
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