分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed上的文章，文章的题目是“A Diselenide Turn-On Fluorescent Probe for the Detection of Thioredoxin Reductase”，通讯作者是波特兰州立大学的Robert M. Strongin教授。首次报道了一种基于联硒化物检测TrxR的荧光探针，该探针具有很高的酶选择性和优异的成像效果。活体中的蛋白质和酶活性的鉴定和定量通常需要使用活检等侵入性程序。这些技术会抑制实时蛋白质水平的测量，组织破坏可能导致有关各种细胞类型中空间分布和差异活性的重要信息的丢失。使用依赖于组织内活化或积累的小型有机荧光探针提供了一种解决这些问题的可靠检测方法。在本文中，描述了在检测硫氧还蛋白还原酶（TrxR）的荧光探针的合成和评估。
哺乳动物中的硫氧还蛋白还原酶是一组硒蛋白，以三种主要亚型存在;在细胞质中为TrxR1，在线粒体中为TrxR2和第三种形式，硫氧还蛋白 - 谷胱甘肽还原酶（TGR），主要在睾丸中表达。在哺乳动物硫氧还蛋白还原酶的C末端活性位点掺入硒代半胱氨酸（Sec）残基使该酶具有更广泛的底物特异性。尽管其与谷胱甘肽还原酶的性质和序列特性相似，但Sec的存在使TrxR具有更高的催化效率。胞质硫氧还蛋白还原酶系统由TrxR1，硫氧还蛋白（Trx）和NADPH组成。NADPH是TrxR1的电子供体，可减少Trx的二硫键。Trx参与活性氧的代谢和细胞中的氧化还原信号传导，通常通过提供另一类蛋白质氧化还原酶过氧化物还原酶的还原等价物。TrxR1在许多癌症中过表达，有助于其生长和增殖，同时抑制细胞凋亡。TrxR1 的水平已被证明与黑色素瘤、人肺癌和前列腺癌的进展直接相关。因此，研究选择性检测TrxR1的方法具有重要意义。目前商业化试剂盒是通过DTNB被TrxR1还原生成TNB并检测其在412nm的吸收值确定，但这个方法对酶的选择性差，也会和细胞内的生物巯基例如谷胱甘肽反应。后期开发了带有二硫戊环淬灭基团的荧光团，通过TrxR还原二硫键，从而进一步不可逆地脱笼从而释放荧光小分子，但是这些探针达到最大荧光发射的时间为120-240 min，后续设计的探针虽然可以在5min达到最大发射，但由于过程可逆，后续会因为巯基的再次氧化导致荧光信号下降。
由于硒元素原子半径大于硫元素，且二硒化物的σ反键轨道能量更低，导致硒醇的pKa小于硫醇，更加容易生成硒醇负离子，且二硒化物亲电性比二硫化物的亲电性强，二硒键的健能低于二硫键所以更加容易断裂，所以作者猜测是否可以利用二硒化合物作为底物来发展TrxR检测的方法学，本篇文章作者开发了带有线性二硒淬灭基团的半萘罗丹明类荧光探针，探针可以在TrxR1的作用下打开二硒键，释放出硒醇离子后进一步进攻氨基甲酸酯的羰基暴露出荧光团。
图1. 对接模拟：（A）探针1a的优化结构（B）探针1b到TrxR1的活性位点。给出了硒原子在仲残基（U498a）上与二硒和二硫键原子之间的距离。探针1a的结合能为-11.1kcal/mol，而探针1b的结合能为-9.6kcal/mol。探针的设计使用AutoDock Vina和UCSF Chimera进行对接。获得了不同构象的探针与Sec（U498）残基的结合能和距离（图1）。TrxR1对1a具有更高的亲和力，结合能(ΔGbind) 为 −11.1 kcal mol−1以，从TrxR6的Sec残基上的硒原子到探针上的硒原子的距离为1.5和6.1 Å。相比之下，二硫探针（1b）的 ΔGbind 值为−9.6 kcal mol −1，与 Sec 残基的距离为 8.1 和 7.5 Å。图2 在TrxR1和NADPH存在下探针1a的开启机制。二硒化物的亲核攻击是通过TrxR1Sec残基发生的。硒化物形成攻击氨基甲酸酯羰基，释放一个氧苯丙酮杂环和荧光2。选择二硒化物探针不仅要考虑TrxR1选择性，还要考虑动力学进行优化。基本原理主要基于探针1a开启响应机制（图2）。图2. 二硒化物探针1a和二硫化物探针1b的合成。为了研究探针的反应性和光学响应，制备了1a（10 μM），0.3% DMSO，0.2% NP-40），EDTA（1 mM）和Tris缓冲液（50 mM，pH 7.4）的水溶液。加入10 μM二硫苏糖醇（DTT）后，溶液立即从无色变为红色。当用手持灯的紫外线照射时，它会发出黄色荧光。图3. 在存在EDTA（1 mM）、BSA（0.2 mg mL−1）的情况下，探针1a的荧光发射与时间的关系。
在磷酸盐缓冲液（1 mM，pH 7.4）中存在EDTA，BSA和NADPH的情况下，使用来自大鼠肝脏的TrxR4的酶测定表明，2的荧光与TrxR1的浓度成正比。 对于0.12单位的酶（约100 nM TrxR1），反应在30 min内稳定。与先前报道的二硫键探针相比，这是有利的，二硫键探针需要120-240 min才能达到平台期。（图3）。
图4. 反应速率与底物浓度的关系，以说明每个底物浓度的反应速度随时间的变化。反应Km为15.89 μM。这个低 Km值是 TrxR1 酶与探针 1a 之间相对较高的亲和力的证据。图5. 探针1a在TrxR1和其他潜在生物还原物种孵育20min时的荧光响应
评估了TrxR1对探针1a的选择性与其他已知的生物还原剂的荧光响应。结果表明，没有一个能提供与TrxR1相当的荧光显着变化（图5）。观察到谷胱甘肽的干扰最小，但TrxR1促进约20倍的荧光。
图6. HCC827细胞的活细胞成像。(ⅰ)对照组。(ⅱ)用10μM的1a或1b处理。(ⅲ)用40μM DNCB和10µM1a或1b处理。1h后，未经处理的细胞无荧光，而经探针处理的细胞有荧光。在引入探针之前，用DNCB预处理细胞会导致荧光减弱。
总的来说，探针1a能够选择性地检测和成像TrxR1。这在确定细胞氧化还原状态和疾病检测方面是有用的。通过LC-MS证实了探针1a的开启机理。在对接研究中，与二硫类似物相比，二硒化合物探针与TrxR1活性位点具有更大的结合亲和力。两种探针1a和1b在肺癌细胞中都有荧光，而用TrxR1抑制剂DNCB预处理的细胞荧光下降。然而，在20μM<DNCB浓度下，1a荧光大于1b。因此，基于二硒化物的探针为检测TrxR过度表达的黑色素瘤提供了一种潜在的工具。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202004094
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