为大家推荐一篇发表在Chem. Sci.上的文章：Rational Design of Thioamide Peptides as Selective Inhibitors of Cysteine Protease Cathepsin L，文章的通讯作者是来自宾夕法尼亚大学的E. J. Petersson，他的课题组主要关注蛋白质探针设计与翻译后修饰研究。
多肽类药物具有强效、安全、选择性高和成本较低等优势，因此多肽成为了药物开发的一个热门方向。然而，多肽作为药物的一个显著的缺点是稳定性差，容易被降解。作者先前在治疗糖尿病的药物胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)上证明，用硫取代多肽主链羰基上的氧形成硫代酰胺会使稳定性产生明显的提高。于是，作者猜想能否将这种硫代酰胺的设计推广到更多的肽类药物上。
组织蛋白酶(Cts)是一类半胱氨酸蛋白酶，参与许多重要的生理过程并与多种疾病有关。其家族成员之一Cts L在若干类肿瘤中高表达，是一个潜在的癌症药物靶点，但目前已知的Cts L小分子抑制剂选择性都不够强，因为将Cts L与Cts其他家族成员区分开来是比较困难的。因此，作者希望利用多肽的高特异性设计一种稳定的硫代酰胺类Cts L肽基抑制剂。首先，作者根据半胱氨酸蛋白酶的底物特异性设计并合成了一段序列包含LLKAAA的短肽探针，在该短肽的N端和C端分别修饰上荧光基团与淬灭基团，因此若其被蛋白酶水解则会有荧光产生。作者用该荧光探针研究了不同位置硫代对多肽稳定性的影响，发现K处的硫代对Cts L表现出极高的抗性，同时还保留了较强的亲和力，是作为抑制剂的理想选择。遗憾的是，这一多肽在体内并不稳定，因为它可以被其他半胱氨酸蛋白酶水解。
于是，作者参考已有的大量关于Cts家族底物特异性的研究，设计了K3A、R3A和R1A等几种短肽序列，作为一个小的抑制剂库进行筛选。为了便于筛选，作者同样在N端和C端分别修饰上了荧光基团用于监测抗水解活性。作者用包含Cts L在内的5种蛋白酶测试了这些多肽的结合特异性，发现K3A和R3A在所有蛋白酶的处理下都在K或R处发生了切割，这与Cts对于碱性氨基酸残基具有偏好性的先验知识是吻合的。于是，作者将K和R处的羰基替换为硫代羰基，发现RS1A对所有蛋白酶都表现出了优异的抗性。接下来，作者又测试了这些多肽与Cts L的结合常数，发现RS1A的结合能力达到了亚μM级别，是一种很好的抑制剂。采用相同的分析方法对其他蛋白酶进行分析，结果表明RS1A对Cts L的抑制能力是对其他Cts的25倍以上，具有很高的特异性。
随后，作者在HepG2细胞裂解液中测试了RS1A的作用。实验显示，RS1A以浓度依赖的方式有效抑制了裂解液中的Cts L活性，并且其半衰期比非硫代类似物大200余倍，初步证明这是一个成功的抑制剂的设计。
最后，作者通过计算模拟的方式研究了R3A和R1A与几种Cts的相互作用。在模拟结构中，硫代酰胺的N-H键与酶催化三联体之一的His形成氢键，从而破坏催化三联体自身的氢键网络，发挥抑制的作用。然而，这种强化的氢键作用只在于Cts L的结合模型中观察到，在于其他Cts进行分子对接时，硫代酰胺反而成为了一个破坏结合的因素，这就解释了R1A的特异性。
综上，作者设计并合成了一种稳定的Cts L选择性肽类抑制剂RS1A，强调了硫代酰胺在多肽类抑制剂中的作用，为多肽类药物的设计提供了新的见解。
本文作者：TZY
责任编辑：LYP
文章链接：
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2021/sc/d1sc00785h
文章引用：DOI：10.1039/D1SC00785H
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