分享的是一篇发表在Chem. Eur J. 上的文章，通讯作者是格罗宁根大学副教授Frank J. Dekker，其主要从事化学生物学，药物化学和有机化学方面研究，特别关注炎症疾病中酶的功能。在本文中，作者针对MIF和MIF2蛋白设计了一种探针，从而对MIF家族蛋白进行亚细胞定位。利用探针，作者确定了MIF大多位于细胞质基质，MIF2则在核上有分布，并进一步确定了MIF2具有核酸酶活性。

MIF蛋白，即巨噬细胞移动抑制因子，其表达失调与癌症与一些炎症性疾病密切相关，针对其进行的一系列靶向疗法的研究目前取得了较好的成果。与此同时，MIF2蛋白被发现其序列和三维结构上都与MIF有许多相似之处，一些物质与MIF和MIF2均可发生相互作用，因此推测两者功能上可能有重叠。也因此有一些研究人员认为MIF2是癌症治疗的潜在靶点。为了对MIF家族蛋白进行更进一步的深入研究，作者设计了一种探针，对其进行亚细胞定位。

探针特异性结合MIF或MIF2从而对其进行原位标记

首先作者在MIF抑制剂4-IPP的基础上进行化学修饰合成探针。4-IPP可以与MIF的N端脯氨酸残基进行共价结合从而对其进行抑制。为了确定将其改造成探针可行的修饰位点，作者选择了其上的三个位点进行化学修饰并测量其IC50值。

表1 4-IPP及其衍生物结合抑制MIF和MIF2互变异构酶活性的亲和力数据。数据代表平均值±标准差（n=3）

结果表明R¹处羧基修饰可以在保留对MIF抑制能力的同时增大其对MIF2的抑制，硝基修饰可以极大程度提高其对MIF的抑制，而对MIF2几乎没有抑制作用。嘧啶环上的修饰对遗址及性能影响不大。因此R¹位点的修饰是合成探针的较好选择。同时R¹硝基修饰的化合物7也可以作为MIF的特异性抑制剂使用。

在确定了修饰位点后，作者在此基础上设计了两种探针，分别是连接荧光基团的probe 8和连接生物素的probe 9.

图1 probe 8和probe 9的化学结构

通过测定两者的IC50值，作者发现其与预测结果相似，具有MIF结合能力的同时对MIF2也具有一定的结合能力。同时发现其改造成探针后，相比R¹羧基修饰的化合物2，对MIF与MIF2的结合能力均有增强。初步证明了探针的可行性。

表2 MIF与MIF2互变异构酶抑制探针的IC50值，抑制常数KI，酶失活率kinact数值

而后作者对探针在细胞裂解液中应用带荧光的probe 8，确定其浓度依赖性与时间依赖性。结果表明其具有明显的动力学差异。探针对MIF的结合效率明显高于MIF2。利用这一动力学差异，作者认为可以通过在较短时间内孵育细胞从而做到MIF的特异性表征，如此短时间内探针对MIF2的结合可以忽略不计，不对结果产生影响。而后作者进一步确定了可以利用先前R¹硝基修饰的化合物7作为MIF的特异性抑制剂，在其预处理细胞后再应用探针既可作到MIF2的特异性表征。

同时作者通过对细胞裂解液应用带生物素的probe 9进行蛋白质谱分析，确定了探针与MIF的结合位点确实为末端脯氨酸残基。至此作者确定了合成的探针的可行性。

图2 探针浓度依赖性与时间依赖性分析以及通过蛋白质谱确定探针与蛋白的结合位点

而后作者利用probe 8对MIF和MIF2进行亚细胞定位。由于前人曾鉴定MIF为核酸酶，其在细胞凋亡诱导因子作用下会被招募到细胞核中，用以切割基因组DNA（hgDNA）从而导致细胞凋亡。因此作者希望使用探针对MIF与MIF2的核易位进行检测。作者用MNNG对细胞进行预处理，而后加入probe 8以及化合物7预处理后加入probe 8对MIF和MIF2进行定向染色。发现在MNNG处理后MIF发生了明显的核易位，确认了前人的观点。同时，作者还发现MIF2也发生了明显的核易位，这也许表明MIF2也具有类似MIF的核酸酶的功能。

图4 在MNNG刺激前后利用probe 8对HeLa细胞中的MIF和MIF2进行亚细胞定位检测核易位过程

最后作者对MIF2的核酸酶活性进行了验证。作者首先确定了MIF2具有PA-EK序列，位置与MIF中发现的PD-EK序列相似。PD-EK序列是许多核酸酶的特征。而后作者将HeLa细胞中纯化的hgDNA与MIF2共同孵育，通过琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行分析.结果表明，虽然MIF2切割hgDNA的活性比MIF低10倍，但确认具有核酸酶活性。同时在使用了probe 8后发现其与MIF和MIF2的结合并不能阻止其对DNA的裂解，这进一步说明了这两者的核酸酶活性位点与互变异构酶活性位点不同。

图5 MIF与MIF2核酸酶活性确认以及其时间浓度依赖性分析

综上，作者证明了在4-IPP基础上合成的探针可以有效标记MIF和MIF2，并利用这一探针针对MIF和MIF2的核易位检测，确定了MIF2的核酸酶活性。这也许会为更多基于MIF家族蛋白的靶向疗法开辟新的机会。

文章作者：QJL

DOI：10.1002/chem.202103030

责任编辑：LD