分享一篇2023年发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，题目是“Unveiling the Crucial Roles of O2•− and ATP in Hepatic Ischemia−Reperfusion Injury Using Dual-Color/Reversible Fluorescence Imaging”。文章的通讯作者为山东师范大学生物医学研究所的唐波教授。肝缺血-再灌注损伤（HIRI）是肝切除和移植手术中严重但不可避免的并发症，包括部分缺血损伤和随后的炎症介导的再灌注损伤两个相互关联的阶段。在HIRI的发展过程中，超氧阴离子（O2•−）和ATP分别作为细胞中重要的活性氧和能量传递的“分子货币”，是在分子水平上早期检测HIRI的潜在生物标志物。然而，测定O2•−或ATP的机制是不同的，独立的，并且通常与活生物系统中O2•−或ATP的检测不相容。更为关键的是，尽管在分别使用O2•−或ATP作为氧化应激标志物或能量代谢标志物来检测HIRI的领域中已经取得了一些进展，但是两者如何在HIRI的整个过程中协调变化，特别是它们在HIRI的病理机制中如何协同调节彼此仍然不清楚，这在很大程度上是由于缺乏在HIRI期间同时和原位监测体内O2•−和ATP的可靠方法。为了解决上述问题，基于光学探针的荧光成像技术具有灵敏度高、空间和时间分辨率高、可在分子水平上观察生物学过程以及无创成像等优点，作者开发了一种能够同时可逆检测O2•−和ATP的荧光探针UDP。该探针不仅可以监测HIRI过程中O2•−和ATP的时空动态，而且可以破译HIRI过程中O2•−和ATP之间的相关性和调控机制。如图1A所示，作者分别选用咖啡酸和罗丹明B作为O2•−和ATP特异性识别基团和相应的荧光团，将它们与二乙烯三胺连接。其中O2•−可以特异性氧化邻苯二酚生成苯醌，从而促进蓝色荧光产生；二乙烯三胺结合位点修饰的罗丹明螺内酰胺衍生物由于其多个氨基而被证明对ATP具有反应选择性。同时，这两种反应都是可逆的，可以动态跟踪O2•−和ATP的波动。在380 nm激发下，470 nm处的蓝色荧光强度随着O2•−浓度的增加（0-65 μM）而逐渐增强，当O2•−浓度从65 μM进一步增加到80 μM时达到平台。O2•−的检测限（LOD）计算为低至34 nM（图1B,C）。随后，作者评估了UDP对O2•−的抗干扰性能。只有O2•−可以触发蓝色荧光的显着增强，而不会受到生物体中发现的其他丰富的ROS，RNS，还原物质和金属离子的干扰（图1D）。当加入ATP时，在各种浓度的ATP（0 - 22 mM）存在下，红色荧光逐渐增强，并在588 nm处达到峰值（图1E）。在0 - 22 mM范围内，以588 nm为中心的荧光强度随ATP浓度呈线性增加，ATP的LOD计算值为14 μM（图1F）。此外，UDP对ATP的选择性高于其他生物物种，包括磷酸腺苷、三磷酸核苷、氨基酸和阴离子/阳离子（图1G）。
图1：A) UDP响应O2•−和ATP的发光可逆机制；B)不同浓度O2•−处理5 min后UDP的荧光光谱；C) UDP在470 nm处的荧光强度与O2•−的关系；D) UDP对O2•−通道中常见干扰物质的选择性；E)不同浓度的ATP处理25 min后UDP的荧光光谱；F) UDP在588 nm处的荧光强度与ATP水平的关系；G) UDP对ATP通道中常见干扰物质的选择性。
然后，作者研究了UDP对O2•−和ATP的可逆响应以及光谱串扰。图2A表明由O2•−激活的蓝色荧光可以被还原物质谷胱甘肽（GSH）有效地淬灭，并且随后加入O2•−可以恢复蓝色荧光。类似地，ATP诱导的UDP的红色荧光也可以被腺苷三磷酸双磷酸酶显著抑制，进一步证明了UDP在体外监测O2•−和ATP动态变化的能力（图2D）。如图2B所示，当加入22mM ATP时，蓝色荧光没有显著变化，表明O2•−通道不能收集UDP响应ATP的荧光信号；同样的，为了验证ATP是否会影响UPD对O2•−的反应，作者发现添加65 μM O2•−未能引起红色荧光的显著增强（图2E）。综上结果，利用UDP的特性使得UDP适合于在HIRI期间在体内同时检测O2•−和ATP。
图2：UDP的可逆性、光谱串扰和生物毒性评价。(A)添加O2•−和GSH时UDP蓝色荧光的可逆响应周期；(B)在ATP存在下，在O2•−通道中加入不同浓度的O2•−后，UDP的荧光光谱；(C) O2•−和ATP反应前后UDP的吸收光谱；(D)添加ATP和三磷酸腺苷双磷酸酶对UDP红色荧光的可逆响应周期；(E)在O2•−存在下，在ATP通道中加入不同浓度ATP后，UDP的荧光光谱；(F)不同浓度UDP孵育后HL-7702细胞的细胞活力。
在证实了UDP在体外响应O2•−和ATP的优异性能后，作者随后研究了在肝细胞中使用UDP同时成像和动态监测内源性O2•−和ATP的可行性。2-ME通过抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性促进O2•−的产生。与对照组相比，2-ME孵育1h后，肝细胞表现出2.8倍的O2•−相关蓝色荧光增强和0.37倍的ATP相关红色荧光减弱（图3A）。然而，经过Tiron （O2•−清除剂）预处理和随后的2-ME孵育后，蓝色荧光降低，相反，红色荧光升高（图3C）。作者还评估了细胞内能量代谢失衡是否会影响氧化还原稳态（图3B）。寡霉素A作为F1F0-ATP酶的抑制剂，可以阻断ATP的合成。寡霉素A治疗1小时后，肝细胞红色荧光降低0.12倍，蓝色荧光升高1.9倍（图3D）。因此，这些结果明确表明，UDP可以作为肝细胞内源性O2•−和ATP变化的实时可视化和可逆监测的强大工具。氧化应激与肝细胞能量代谢之间的密切关系通过分化的O2•−蓝色荧光信号和ATP红色荧光信号得到证实。
图3：2-ME或寡霉素A刺激肝细胞中O2•−和ATP波动的共聚焦荧光成像。(A)共焦荧光图像O2•−（蓝色通道）和ATP（红色频道）在肝细胞通过2-ME和Tiron孵育后，通过UDP染色；(B)共焦荧光图像O2•−和ATP在肝细胞通过寡霉素A 和ATP孵育后，通过UDP染色。(C, D) (A)和(B)的相对蓝色和红色荧光强度输出。
接下来，作者利用UDP来实现HIRI细胞中O2•−和ATP的动态成像。为了详细追踪HIRI整个过程中的O2•−和ATP，作者将肝细胞分为5组，分别监测缺血和再灌注各阶段的O2•−和ATP水平，分别为对照组、缺血20 min组、缺血40 min组、缺血40 min后再灌注20min组和缺血40 min后再灌注40min组。如图4A所示，随着缺血时间的延长，肝细胞红色荧光减弱，蓝色荧光略有上升。与正常细胞相比，缺血40 min后，红色荧光减少0.22倍，蓝色荧光增强1.9倍，表明ATP显著减少，O2•−增加。缺血肝细胞再灌注后，蓝色荧光明显增加。缺血再灌注40 min的肝细胞蓝色荧光较对照组增强3.3倍（图4B）。这种现象归因于再灌注过程中O2•−的剧增。与缺血40 min的肝细胞相比，随后的再灌注使红色荧光略有恢复，但ATP水平仍明显低于正常组。缺血再灌注40 min的肝细胞红色荧光比正常肝细胞低0.32倍。再灌注时ATP水平的轻微升高与肝细胞氧化磷酸化的恢复有关，作者推测O2•−的爆发和腺嘌呤核苷酸的泄漏影响了ATP水平的恢复，导致再灌注时ATP略有恢复。缺血40分钟后，细胞内ATP浓度从13 nmol/mgprot急剧下降至3.3 nmol/mgprot，而再灌注40分钟后，肝细胞内ATP浓度从3.3 nmol/mgprot缓慢上升至4.9 nmol/mgprot（图4E）。HIRI期间，结合商用ROS和ATP试剂盒测定的ROS和ATP水平与使用UDP的荧光成像现象一致。因此，这些结果证实了UDP在HIRI期间检测肝细胞中O2•−和ATP的成像能力。接下来，作者利用蓝色和红色荧光的协同变化评估了HIRI药物的干预作用。乙酰半胱氨酸（NAC）是一种有效的药物，通常用于通过直接去除活性氧来保护肝脏免受HIRI。0.5 mM NAC预处理1h的HIRI肝细胞，蓝色荧光明显减弱，红色荧光明显恢复。此外，与未经NAC干预的HIRI肝细胞相比，1 mM NAC预处理的HIRI肝细胞的蓝色荧光降低了0.31倍，红色荧光增强了2.9倍（图4B,C），这表明NAC干预可以在HIRI期间去除O2•−并恢复ATP水平。因此，上述结果证实，UDP可以提供HIRI期间肝细胞O2•−和ATP波动的动态可视化，可以有效评价NAC的效果。
图4：HIRI全过程中肝细胞O2•−和ATP波动的动态可视化及HIRI药物NAC的干预效果(A)缺血0、20、40 min和缺血40 min后再灌注20、40 min的肝细胞，用UDP 荧光成像O2•−和ATP， 0.5、1 mM NAC预处理。(B, C) (A)的相对蓝色和红色荧光强度输出。(D) ROS含量测定试剂盒测定HIRI不同时期的相对ROS水平。(E) ATP含量测定试剂盒测定HIRI不同时期的ATP水平。
随后，作者进行了HIRI期间小鼠肝脏中O2•−和ATP的实时成像。作者利用微血管钳阻断肝动脉和门静脉血液供应，导致肝脏血流剥夺约70%，然后取出微血管钳进行再灌注过程建立小鼠HIRI模型。将小鼠分为5组，分别为对照组、缺血20 min组、缺血40 min组、缺血40 min后再灌注20min组、缺血40 min后再灌注40min组，以成像HIRI整个过程中O2•−和ATP的波动情况。然后通过尾静脉给五组小鼠注射UDP，收集肝脏内蓝色和红色荧光信号（图5A）。如图5B所示，随着缺血时间的延长，红色荧光明显下降，而蓝色荧光略有增加，说明肝脏中ATP含量在缺血期间急剧下降，O2•−水平没有显著增加。与正常组相比，缺血40min后红色荧光下降0.30倍，蓝色荧光上升1.5倍（图5C,D）。与缺血40 min的小鼠相比，随后的再灌注导致O2•−的蓝色荧光明显增强，ATP的红色荧光略有升高，这表明在再灌注期间O2•−的快速积累发生，而ATP则略有上调。缺血40 min再灌注40 min小鼠肝脏的蓝色荧光和红色荧光分别是对照组的3.2倍和0.43倍。同时，腹腔注射UDP后，对对照组和HIRI组小鼠主要脏器组织进行H&E染色，观察组织学变化。结果显示，对照组的心、肝、脾、肾、肺组织均未见明显损伤，而HIRI小鼠肝组织细胞质轻度染色，门静脉区附近有少量淋巴细胞和粒细胞聚集，表明HIRI小鼠发生肝损伤（图5E）。因此，这些结果证实，UDP适合作为一种强大的体内生物成像工具，用于HIRI小鼠肝脏中O2•−和ATP的实时和动态可视化。
图5：HIRI期间小鼠肝脏中O2•−和ATP动态的实时可视化。(A)程序图。(B)缺血0、20、40 min和缺血40 min后再灌注20、40 min小鼠肝脏中O2•−和ATP处理后利用UDP孵育的荧光成像。(C, D) (B)的相对蓝色和红色荧光强度输出。(E)对照组和HIRI小鼠心脏、脾脏、肾脏、肺和肝脏的H&E染色。
SDH是三羧酸循环中作为关键酶，并且在调节细胞内ATP水平中不可或缺。为了研究O2•−对SDH的特异性失活机制，作者对SDH进行了LC-MS的蛋白质组学分析，探讨O2•−对SDH的翻译后修饰作用。如图6所示，SDH活性区域的组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸残基被O2•−氧化。因此，作者推测HIRI期间过量的O2•−氧化组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸残基在SDH中，导致SDH失活。
图6：通过LC - MS/MS分析SDH与O2•−反应的蛋白质组学。
在发现HIRI肝细胞中SDH活性显著降低后，作者接下来关注过量O2•−引起的SDH下游失活。如图7B所示，SDH抑制剂3-NPA处理的肝细胞线粒体NADH含量从0.93 nmol/mgprot降至0.39 nmol/mgprot，表明SDH失活有效下调了线粒体NADH水平。作者同时研究了肝细胞线粒体NADH含量的降低是否会影响HIRI期间线粒体能量（ATP）的产生。1 mM NADH暴露于正常细胞1小时后，增加的NADH可使线粒体NADH含量从0.90 nmol/mgprot增加到1.8 nmol/mgprot（图7C），肝细胞线粒体ATP水平从8.7 nmol/mgprot迅速增加到13.6 nmol/mgprot（图7D），添加外源性NADH后，肝细胞内ATP含量显著高于未添加NADH的正常组，而3-NPA预处理后再添加NADH导致细胞内ATP含量降低。HIRI肝细胞ATP含量明显下降，并且通过添加外源性NADH也可以逆转HIRI肝细胞ATP含量的下降（图7G）。因此，上述结果表明，肝细胞线粒体NADH含量的降低导致HIRI期间线粒体和细胞内ATP水平的显著降低。基于以上实验，首次揭示了HIRI过程中细胞内O2•− SDH - Mito NADH - Mito ATP -细胞内ATP级联信号通路的作用（图7H）。
图7：HIRI中涉及O2•−和ATP的潜在信号通路。(A)不同处理下肝细胞SDH活性测定。(B, C)不同处理下肝细胞线粒体NADH含量分析。(D)不同治疗组肝细胞线粒体ATP含量分析。(E) 3-NPA作用下肝细胞ATP的UDP荧光成像。(F) (E)的相对红色荧光强度输出。(G)不同处理组肝细胞胞内ATP含量分析。(H) HIRI期间细胞内O2•−SDH - mitto NADH - mitto ATP -细胞内ATP级联信号通路示意图。
综上所述，该团队开发了一种对O2•−和ATP具有高灵敏度和高选择性的双色双可逆分子平台(UDP)，实现了HIRI中O2•−和ATP的同时检测。UDP在体外对O2•−和ATP响应的优异性能，使其能够同时成像和动态监测肝细胞内源性O2•−和ATP。更重要的是，UDP实现了HIRI期间小鼠肝脏中O2•−和ATP的可视化。最后，首次揭示了HIRI细胞内O2•−- SDH - mitto NADH - mitto ATP -细胞内ATP级联介导的信号通路。
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