为大家分享一篇发表在AC上的文章Photoreactive Probe-Based Strategy Enables the Specific Identification of the Transient Substrates of Methyltransferase at the Proteome Scale，通讯作者是大连化物所的叶明亮老师和王科云老师，他们的实验室主要研究蛋白质质谱分析技术相关内容，其中王老师主要研究方向是蛋白质甲基化修饰。蛋白精氨酸的甲基化修饰是一种广泛存在的PTM，研究甲基化修饰的底物对了解甲基化修饰本身非常重要。研究蛋白及其底物的常见方法是亲和质谱（AP-MS），但甲基转移酶和底物结合弱且短暂；另一种研究方法是使用甲基化供体SAM类似物，将可富集的标签转移到甲基化底物上，但并非所有的甲基化转移酶都能高效利用SAM类似物。因此亟需开发新的甲基化转移酶底物鉴定方法。光交联技术是一种非常好的用来识别较弱的相互作用的方法，在本文中作者便基于光交联技术设计了化学探针，在全蛋白质组水平对甲基转移酶PRMT的底物进行了系统性的分析。PRMT1是主要的I型PRMT，其底物结合口袋包含2个带负电的酸性氨基酸E46和D51。作者首先分别纯化了WT和E46K、D51R突变的PRMT1突变体，进而合成了三功能的化学探针，其分别带有用于和PRMT1相连的NHS基团、光交联基团芳基叠氮和用于富集的Biotin基团。在作者的设计中WT PRM1将富集底物蛋白和非特异结合蛋白，突变PRM1只能富集到非特异结合蛋白，两者相减即可识别PRM1的甲基化底物蛋白。化学探针与PRMT1结合后并不会改变其酶活，而串联质谱显示大部分PRMT1 E46K不会被化学探针所标记，因此该突变体可作为良好对照。作者首先在细胞裂解液中检查了PRMT1 WT能否捕获底物蛋白，通过富集和LC-MS/MS分析并将鉴定到的蛋白与数据库比较作者发现捕获效率非常低，推测原因可能是正常条件下这些底物蛋白带有高水平的甲基化，阻碍了PRMT1与它们的结合。因此作者使用腺苷双醛（Adenosine dialdehyde, Adox）抑制了甲基转移酶，降低了内源甲基化水平。组学实验证明了Adox的加入显著增加了已知甲基化底物的鉴定数量。接着作者应用定量蛋白质组学，使用PRMT1 WT和突变体探针在低甲基化样品中进行底物鉴定，并鉴定到18个显著上调的蛋白。这些蛋白全都含有RG/RGG结构域，其中15个都是已知的PRMT1底物，因此其余3个蛋白非常可能是PRMT1的底物蛋白。作者接下来对这3个未知蛋白进行了验证。虽然在PRMT1敲除的实验中作者没有观察到三者下调的甲基化位点，但在体外实验中做作者成功证明了它们可以在PRMT1和SAM下被显著甲基化，且这些位点在之前被报道过的确存在甲基化，表明它们在活细胞中也是PRMT1的甲基化底物。综上，作者在本文中开发了一种光交联方法，成功鉴定到了PRMT1的3个甲基化底物蛋白，为后续的生物学研究提供了新方向。
本文作者：LYP
责任编辑：TZY
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.3c01598
文章引用：DOI: 10.1021/acs.analchem.3c01598
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